книги / Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами

Следует отметить, что реакция фотобактерий на ультразвук мо­ жет заметно меняться в зависимости от их возраста, исходного состоя­ ния, наличия в среде тех или иных составляющих и т. д.

Отличия в чувствительности различных клеток к ультразвуково­ му воздействию связаны с их морфологическими особенностями и функциональным состоянием.

В первую очередь, резистентность клеток к ультразвуку определя­ ется структурой их оболочки, в наибольшей степени подверженной влиянию факторов, действующих в ультразвуковом поле. В непосред­ ственной близости от клеточных мембран как внутри, так и вне клет­ ки, наблюдаются периодические механические воздействия и энер­ гичные акустические микропотоки. Напряжения сдвига под влиянием этих микропотоков могут достигать весьма больших величин (102...103 Н /м2). Однако уже 10 Н /м2 (5...60 мин воздействия) оказыва­ ется достаточно, чтобы уменьшить время жизни эритроцитов и повы­ сить их чувствительность к осмотическому лизису, увеличить прони­ цаемость цитоплазматических мембран и изменить их поверхностную энзиматическую активность, понизить поверхностный заряд и увели­ чить скорость оседания эритроцитов в поле гравитационных сил.

Переменные напряжения в акустическом поле, расшатывающие структуру клеточной мембраны, и микропотоки, «смывающие» мак­ ромолекулы с поверхности клеток, приводят к повышению межфазно­ го натяжения на границе мембрана - среда.

Стремление энергии Гиббса системы к минимуму обусловливает дополнительные напряжения в мембране, приводящие к уменьшению поверхности клетки и снижению ее поверхностной энергии. Это повы­ шение напряжения приводит, например, к изменению формы клеток Не Ьа при кратковременном ультразвуковом воздействии (1 Вт/см2; 0,8 МГц; 1 мин), незначительной деформации эритроцитов в сходных условиях и т.д. Оно сохраняется, пока поверхностная энергия не уменьшится до исходных значений в результате адсорбции белка и дру­ гих поверхностно-активных веществ из окружающей среды.

Десорбция с поверхности клеток под действием ультразвука нека­ витационных интенсивностей (0,05...0,3 Вт/см2; 1 МГц; 5...60 мин) мо­ лекул белков, гликопротеинов и, возможно, других биополимеров подтверждается изменениями энзиматической активности поверхно­ сти эритроцитов, потерей эритроцитами, лимфоцитами и соматиче­ скими клетками человека антигенов, связанных с их мембранами, по­ вышением адгезивных свойств клеток, появлением в супернатанте за­ метных количеств гликопротеидов.

В результате ультразвукового облучения (0,05 Вт/см2; 0,88 МГц) суспензии эритроцитов (17000 кл./мм3) в физиологическом растворе в первую же минуту с поверхности каждой клетки десорбируется при­ мерно 2 • 10"14 г вещества белковой природы (для сравнения: масса

хариды и другие биомакромолеку­ лы. Благодаря белковому покрытию межфазное натяжение между

клеточной мембраной и окружающей средой составляет всего (0,1...2)- 10_3Дж /м2. Белковые молекулы, способные взаимодейст­ вовать и с липидами мембран, и с окружающей средой, ведут себя как поверхностно-активные вещества.

Межфазное натяжение на границе липид-вода составляет около 30 • 10"3 Дж/м2, и молекулы белка, обладая поверхностной актив­ ностью, стремятся адсорбироваться на этой поверхности, снизить меж­ фазное натяжение, а следовательно, и свободную энергию поверхности.

Если клеточные мембраны после ультразвукового воздействия сохра­ нили свою структурную целостность, то их функциональные характери­ стики восстанавливаются в течение 10...60 мин. Это восстановление, по-видимому, обеспечивается как функционированием специфических репаративных механизмов, так и процессами резорбции на поверхности мембраны белковых молекул, «смытых» микропотоками. Для заметного снижения межфазного натяжения на поверхности раздела между слоем липидов и белковым раствором должно адсорбироваться довольно много белка, поскольку его поверхностная активность невелика.

О низкой поверхностной активности биомакромолекул свиде­ тельствует известный факт: статическое (установившееся) поверхно­ стное натяжение плазмы крови, содержащей 7...8 % белка, на границе с воздухом всего лишь на 20...25 Н/м ниже, чем у воды. Время форми­ рования межфазной поверхности может составить десятки минут, так как коэффициент диффузии крупных белковых молекул в водных растворах относительно мал, что существенно ограничивает скорость их сближения с поверхностью.

Если измерить поверхностное натяжение раствора белка на об­ новляющейся поверхности, например, в потоке или на поверхности капли, формирующейся на конце пипетки, то значение этого дина­ мического поверхностного натяжения практически не будет отли­ чаться от значений, характерных для воды. Присутствие в среде микропузырьков газа резонансных размеров значительно увеличи­ вает эффективность ультразвукового воздействия на клеточную по­ верхность.

В модельном эксперименте вблизи погруженной в воду гидрофоб­ ной мембраны с порами диаметром 3,2 мкм, в которых стабилизированы газовые пузырьки, необратимая агрегация тромбоцитов наблюдается под действием ультразвука (1 МГц) с интенсивностью 32 мВт/см2. Если ин­ тенсивность не превышает 30 мВт/см2, агрегация обратима.

Эффект обусловлен микропотоками вблизи тромбоцитов, очень чувствительных к сдвиговым усилиям. Тромбоциты начинают агреги­ ровать, если напряжение сдвига достигает всего 5 Н /м 2.

В этих же условиях из эритроцитов высвобождается АТФ, что можно фиксировать по свечению люциферин-люциферазного ком­ плекса, добавленного в суспензию. Порог этого явления также лежит в области 20...30 мВт/см2. В отсутствии пузырьков газа или при более низких интенсивностях ультразвука эффекты не наблюдаются.

Значительно слабее действует ультразвук на двухслойные липид­ ные мембраны, лишенные белкового покрытия. Долго не удавалось обнаружить изменений в электроемкости, проводимости или разно­ сти потенциалов искусственной мембраны, облучаемой ультразвуком с частотой 1 МГц и интенсивностью в интервале 0,1...4 Вт/см2. Более высокие интенсивности ультразвука приводят к фрагментации мем­ бран. Однако ультразвук (0,6 Вт/см2; 0,88 МГц) в определенных усло­

виях значительно - на 60... 100 % - увеличива­

Клетки ацетабулярии (рис. 3.6) длиной до 5 см и диаметром 0,3...

...0,5 мм покрыты прочной оболочкой, толщина которой достигает 30 мкм. Более 90 % объема клетки занимает вакуоль. Протоплазма, рас­ положенная между вакуолью и оболочкой, имеет толщину 10...12 мкм.

Потенциал покоя ацетабулярии - максимальная разность электри­ ческих потенциалов между вакуолью в внешней средой - составля­ ет 170 мВ. Потенциал покоя обусловлен функционированием насоса С1-ионов с равновесным калиевым потенциалом, составляющим 90 мВ. Внешние раздражители приводят к изменению потенциала покоя. Раз­ ность потенциалов устанавливается при этом на уровне 80 мВ и не меня­ ется в течение действия внешнего фактора.

Однако ацетабулярия, как и многие другие клетки, способна к ино­ му типу реакции на внешнее воздействие - генерации волны электри­ ческого возбуждения (потенциала действия). Отличительной особен­ ностью потенциалов действия ацетабулярии является их большая дли­ тельность, достигающая нескольких минут, что существенно облегчает изучение процесса возбуждения. Амплитуда потенциала действия в среднем равна 110 мВ.

Специальная приставка к микроскопу (рис. 3.7) позволяет контро­ лировать введение микроэлекгродов и наблюдать за явлениями в клетке в процессе ультразвукового облучения.

Рис. 3.7. Приставка к микроскопу для изучения реакции изолированной клетки на ультразвуковое воздействие:

1 - акустический преобразователь; 2 - поглотитель ультра­ звука; 3 - кольцевая осветительная арматура; 4 - светоне­ проницаемый кожух; 5 -лампочки накаливания; б -терм о- статирующая рубашка; 7 - корпус из светонепроницаемого материала; 8 - полость, заполненная жидкостью, рассеиваю­ щей свет; 9 - покровное стекло; 10 - исследуемый объект;

11 - объектив микроскопа; 12 - микроэлектрод

ществование порогов ультразвуковых воздействий.

Вследствие деполяризации мембран под действием ультразвука пороговой интенивности достигается критическая величина деполя­ ризации, после чего генерируется потенциал действия. При интен­ сивностях выше пороговых потенциал действия возникает через 2...5 с после включения ультразвука. В области интенсивностей ульт­ развука, близких к пороговым (а также при малой индивидуальной

Визуальные наблюдения за клеткой во время ультразвукового воз­ действия позволяют обнаружить активизацию движения цитоплазмы. Этот эффект наблюдается и при воздействии другими раздражителями (локальное повышение или понижение температуры, введение микроэлектродов и т. д.) и, по-видимому, является результатом неспецифиче­ ской реакции клетки на внешнее воздействие.

При относительно высоких интенсивностях ультразвука (0,6...1 Вт/см2) наблюдается значительная деполяризация клеточных мембран. После выключения ультразвука потенциал через 2...5 мин устанавливается на уровне 90 мВ. Этот уровень регистрируется 25...40 мин, после чего потенциал возвращается к исходным значени­ ям (потенциал покоя). По-видимому, ультразвуковое воздействие с интенсивностью, превышающей 0,6 Вт/см2, не только нарушает диф­ фузионное равновесие на мембране, но и ингибирует активный транс­ порт ионов СГ. После выключения ультразвука диффузионное равно­ весие восстанавливается в течение нескольких минут, и лишь значи­ тельно позже начинает функционировать активный транспорт.

Увеличение интенсивности ультразвука до 1 Вт/см2 (3...5 мин) вызывает структурные нарушения - разрывы и контрактуру цито­ плазмы, появление пузырьков, перемешивание клеточного содержи­ мого. Однако ни при этих, ни при более высоких интенсивностях ультразвука (до 2 Вт/см2) не отмечалось разрушения клеток. Высокая механическая прочность ацетабулярии, очевидно, обусловлена боль­ шой (до 30 мкм) толщиной ее клеточной стенки.

По-видимому, наиболее известное явление, связанное с деполяри­ зацией клеточных мембран, - это изменение их проницаемости. Зако­ номерное увеличение проницаемости под действием ультразвука хо­ рошо проявляется в клетках в суспензии - эритроцитах, лейкоцитах, клетках дрожжей и пр.

Исследования, проведенные на суспензии эритроцитов в физио­ логическом растворе, показали, что ультразвук существенно увеличи­ вает скорость диффузии глюкозы и сахарозы в клетки из богатой саха­ рами среды.

Концентрация углеводов в среде, содержащей эритроциты, прак­ тически не меняется в течение 4 ч при 20 °С. Воздействие ультразву­ ком (0,1 Вт/см2; 0,9 МГц; 20 мин) приводит к заметному уменьшению концентрации сахаров в среде. После выключения ультразвука угле­ воды частично выводятся из эритроцитов (рис. 3.10).

Скорость выхода ионов калия из эритроцитов вдвое возрастает при увеличении интенсивности ультразвука от 0,2 до 0,6 Вт/см2 (0,9 МГц). Эффект при кратковременном воздействии (3...5 мин) обратим, так как работа Ыа+-К+ насоса, функционирующего за счет энергии АТФ, восста­ навливает исходную концентрацию ионов К+ в клетке после прекраще­ ния ультразвукового воздействия. Если активность АТФ-азы подавить,

при подавлении ультразвуком ак­ тивности Ыа+-К+-АТФ-азы приводит к существенному изменению со­ става внутриклеточной среды.

Скорость переноса через биологические мембраны относительно крупных молекул практически не изменяется под действием ультразву­ ка. Так, проницаемость мембран эритроцитов цыплят по отношению к меченому лейцину не испытывает достоверных изменений после 30-минутного воздействия ультразвуком со средней интенсивностью 0,6 Вт/см2 и частотой 1 МГц, а скорость накопления меченого тимидина в этих же условиях (гп ьИго) даже несколько уменьшается.

Отсутствие эффекта увеличения под действием ультразвука про­ ницаемости клеточных мембран по отношению к лейцину и тимидину вызывает у некоторых исследователей скептическое отношение к воз­ можности увеличить проницаемость мембран и для других веществ. Тем не менее ультразвук (0Д...2 Вт/см2; 0,88 МГц; 5...60 мин) сущест­ венно увеличивает чувствительность бактериальных клеток к анти­ биотикам, широко используется в клинике для введения лекарств в организм сквозь неповрежденную кожу (фонофорез), в гистохимии для импрегнации нервных тканей серебром и т. д.

Изменения в свойствах клеточных мембран, подвергнутых ультра­ звуковому воздействию, могут быть вызваны переменными усилиями, возникающими в жидкости при распространении ультразвуковой волны.

Частицы жидкости в ультразвуковом поле колеблются относи­ тельно состояния равновесия с частотой ультразвука. У поверхности благодаря силам сцепления частицы практически неподвижны, одна­ ко амплитуда скорости смещения быстро увеличивается по мере уда­ ления от поверхности. Компонента скорости, касательной к поверхно­ сти на расстоянии 2 от этой поверхности

и=и0[со5<й(-е р2со$о»^—(52'],

где (Г1 = (2т\/ юр0) 1/2;

мо - амплитуда скорости в объеме жидкости вдали от поверхности; ш - круговая частота; ро - плотность жидкости; Т| - вязкость жидкости.

Скорость и достигает мо при Р2, т. е. 2 » Р-1, где Р_| имеет размер­ ность длины и представляет собой толщину слоя, где скорость меняется от 0 до мо. Эта величина называется толщиной акустического поверхно­ стного слоя.

Эи/д2 = рм0 при мо = 0,04 м/с, а {рж1м = 7 .ю 4с-1. Переменное напря­ жение сдвига, обусловленное градиентом Р0 =г)Рм0 =(сот)р0 / 2)*/2, и

составляет 100 Н /м 2 (0,1 Вт/см2; 1 МГц). Это значение по абсолютной величине превосходит уровень, при котором разрушаются мембраны эритроцитов (60 Н /м 2).

Изменяясь с удвоенной частотой ультразвука, переменные напря­ жения сдвига «не успевают» обусловить механических повреждений в клеточной мембране, изменяют, однако, состояние ее поверхности: на­ рушают двойной электрический слой, смещают глобулы белков, распо­ ложенные на поверхности мембран, снижают диффузионные ограниче­ ния и т. д. В результате изменяются мембранный потенциал (^-потен­ циал) и проницаемость мембран, возможны также конформационные переходы в мембранных белках, ведущие к изменению их фермента­ тивной активности.

Таким образом, переменные высокочастотные возмущения вбли­ зи мембран могут «детектироваться» клеточной мембраной, обуслов­ ливая изменения в свойствах клеток, заметные в течение весьма дли­ тельного времени (до десятков минут) после прекращения ультразву­ кового воздействия.

Скорость оседания эритроцитов, например, увеличивается в ре­ зультате воздействия ультразвуком с интенсивностью 8 мВт/см2 (1 МГц), что, вероятно, свидетельствует об уменьшении их поверхно­ стного заряда.

Мембранный потенциал эритроцитов крысы заметно уменьшает­ ся под действием ультразвука и возвращается к исходным значениям через 15...30 мин после прекращения облучения.

Уменьшается на 5... 10% электрофоретическая подвижность кле­ ток асцитной карциномы Эрлиха, подвергнутых действию ультразву­ ка (0,5...3,2 МГц; 10 Вт/см2 5РТА). Понижается электрофоретическая подвижность и лимфомы мышей (2 МГц; 10 Вт/см2 ЗРТА). Эффект

обнаруживается только при кавитации и заметно уменьшается с по­ вышением статического давления или при укорочении длительности акустического импульса, т. е. при условиях, когда возникновение ка­ витирующих пузырьков затруднено.

Часть клеток при облучении ультразвуком разрушается, но клет­ ки, пережившие воздействие, по внешнему виду и способности к про­ лиферации не отличаются от контрольных, хотя их электрофоретиче­ ская подвижность возвращается к нормальным значениям лишь через

45...50 ч.

3.3.1.Действие ультразвука на внутриклеточные структуры

Реакция клетки на ультразвук не ограничивается изменениями только в ее поверхностных структурах. В клетках, помещенных в ульт­ развуковое поле, возникают энергичные микропотоки, перемешиваю­ щие ее содержимое, меняющие взаиморасположение клеточных органелл. Источниками таких микропотоков может оказаться пульсирую­ щий газовый пузырек, если расстояние между ним и клеткой не превышает 5 • 10~2 см.

По всей вероятности, ультразвук оказывает влияние не только на жизнедеятельность клетки в целом, но и на структуру и функции от­ дельных клеточных органелл.

Под влиянием ультразвука (0,2 Вт/см2; 0,88 МГц) меняются усло­ вия транспорта ионов через мембрану митохондрий, наблюдается ра­ зобщение свободного дыхания и фосфориллирующего окисления в них. Степень разобщения возрастает при увеличении интенсивности ультразвука от 0,05 до 1,2 Вт/см2, достигая максимума при 1 Вт/см2 (0,88 МГц; 5 мин). При 2,5 Вт/см2 (1 МГц; 5 мин) возникают наруше­ ния в мембранах лизосом, что можно наблюдать на типичной картине лизиса клеток печени крыс. Аналогичный эффект наблюдается и под действием низкочастотного (20 кГц) ультразвука.

В определенных условиях ультразвук (2 Вт/см2; 0,75 МГц) может вызвать разрушение ядер в клетках Не Ьа, не нарушая при этом целост­ ности цитоплазматических мембран. Такие специфические нарушения не могут быть обусловлены кавитацией и микропотоками и предполо­ жительно объясняются возникновением резонансных волн на поверхно­ сти ядерных мембран. Кроме того, ультразвук (0,5...3 Вт/см2; 0Д..2 МГц; 2.. .10 мин) вызывает изменение числа гранул гликогена в клетках, нару­ шение целостности эндоплазматического ретикулума, увеличение коли­ чества лизосом, изменение структуры митохондрий в клетках и т. д.

Несмотря на кажущуюся простоту ситуации, в настоящее время оказывается весьма непросто выделить первичные явления в клетке, вызванные физико-химическими процессами в ультразвуковом поле.

Действительно, количество гликогена в клетке, число и актив­ ность лизосом, форма саркоплазматической сети меняются в широких пределах в процессе жизнедеятельности. Поэтому наблюдаемые под действием ультразвука изменения могут свидетельствовать только о биологической реакции клетки на внешнее неспецифическое воздей­ ствие. Если ультразвуковое воздействие оказалось не летальным для клетки, то возникшие в ней изменения репарируются в течение при­ мерно 100 ч. Лишь митохондриям необходимо значительно больше времени для восстановления своей структуры и функции.

3.3.2. Последействия ультразвука на жизнедеятельность клетки

Наблюдая за клеткой после облучения ультразвуком, можно обна­ ружить, что в течение достаточно длительного времени в клетке раз­ виваются процессы последействия, приводящие к морфологическим и функциональным изменениям.

Некоторые из наблюдаемых процессов, например увеличение проницаемости и уменьшение мембранного потенциала под действи­ ем ультразвука и последующее возвращение этих параметров к исход­ ным значениям, по крайней мере, частично, обусловлены достаточно простыми физико-химическими явлениями.

Так, состояние поверхности клетки, нарушенное ультразвуковы­ ми микропотоками, способными «смыть» поверхностно-активные биомакромолекулы, самопроизвольно восстановится, по меньшей ме­ ре, через несколько минут.

Длительно в реальном масштабе времени и восстановление доннановского равновесия, обусловленного разделением ионов на мем­ бране и нарушаемого микропотоками, увеличивающими градиенты концентрации.

Оба процесса - адсорбция поверхностно-активных веществ на клеточной мембране и восстановление равновесия Доннана контроли­ руются диффузией и достаточно медленны.

Сравнивая время восстановления биологических функций кле­ точных мембран со временем, характерным для формирования по­ верхностей раздела в растворах, содержащих высокомолекулярные поверхностно-активные вещества, можно видеть, что эти величины совпадают в пределах порядка.

Так, электрофоретическая подвижность эритроцитов, сниженная в результате ультразвуковой обработки (0,02... 1 Вт/см2; 0,4 МГц и 0,8 МГц; 3 С...З мин), восстанавливается через 3...5 мин после выключе­ ния ультразвука. В течение 15...30 мин остается повышенной прони­ цаемость мембран эритроцитов и лимфоцитов для молекул красителя трипанового синего.