Добавил:

amanhfz Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Кубанский государственный медицинский университет

Предмет:

Медицинская биология и генетика

Файл:

ПРАКТИКУМ Гентех в мед ЛЕЧ 4 02 24

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

27.02.2024

Размер:

3.18 Mб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 23 / 63 4 5 6 > Следующая >>>

нального эпителия, культивированных и некультивированных клеток амниотической жидкости, различных тканей из абортного материала, а также крови.

Метод гибридизации in situ имеет особое значение для практической цитогенетики, благодаря разработке неизотопного варианта, основанного на использовании зондов, м е- ченных нерадиоактивными модифицированными нуклеотидами. Неизотопные варианты гибридизации на препаратах (в особенности флюоресцентные) имеют ряд преимуществ по сравнению с изотопными: большую разрешающую способность, которая равна разрешающей способности микроскопа (0,1 - 0,2 мкм), отсутствие необходимости в статистической обработке результатов, быстроту и безопасность для здоровья исследователей

Кроме того, комбинация различно модифицированных проб, выявляемых с помощью разных систем детекции, позволяет одновременно определять местоположение двух и более последовательностей ДНК в одной клетке или на одной метафазной пластинке. А использование в качестве ДНК-зондов повторяющихся последовательностей, меченых флюорохромами, сокращает время проведения процедуры до 7-9 часов (классический неизотопный вариант гибридизации занимает два дня, изотопные варианты от недели до месяца), что особенно важно для пренатальной диагностики. Использование метода FISH в цитогенетической диагностике позволяет идентифицировать структурные хромосомные перестройки, устанавливать природу маркерных хромосом, проводить анализ численных нарушений хромосомного набора, как на метафазных хромосомах, так и в интерфазных ядрах.

Принцип FISH-метода

В основе FISH-метода лежит реакция гибридизации между искусственно созданным ДНК-зондом и комплементраной ему нуклеотидной последовательностью ядерной ДНК. Молекула ДНК представляет собой две спирально соединенные нуклеотидные цепи, а гибридизация возможна только в том случае, если цепи разойдутся. Чтобы разъед инить нуклеотидные цепи ДНК прибегают к денатурации (для последующей гибридизации денатурированной должна быть как ДНК в ядрах исследуемого образца, так и сам ДНКзонд). После денатурации ДНК-зонд гибридизуется с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа.

Рисунок 4

Схема эксперимента по флуоресцентной гибридизации in situ для локализации положения гена в ядре.

Протокол постановки FISH:

1.Подготовка гистологического или цитологического препарата . Подготовка ги-

стологического препарата осуществляется по стандартной схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза на предметное стекло и депарафинизация. При подготовке цитологического препарата используются специальные осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную суспензию клеток.

2.Предварительная обработка (если необходимо). Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют гибридизацию.

3.Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация. Для того, что-

бы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85-90°С.

4.Гибридизация. После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (37°С в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов (продолжительность инкубации указана в каждом кон-

кретном протоколе). В настоящее время для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры.

5.Промывка. После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC).

6.Контр-окрашивание. При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4,6-

диамидин-2-фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК.

7.Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа . Выполнение рутинных операций (депарафинизация, предварительная обработка, промывка) может быть автоматизировано.

5.Выучить алгоритм проведения хромосомного микроматричного анализа (ХМА).

Молекулярное кариотипирование – это высокоточный метод определения хромосомной патологии, позволяющий определять различные изменения хромосом, обычно не выявляемые другими методами, в том числе кариотипированием. В основе метода лежит использование микроматрицы или ДНК-чипа, на котором расположено около 1 млн маркеров, соответствующих участкам хромосом. После нанесения образца ДНК пациента на матрицу и ее сканирования, врач получает информацию о наличии или отсутствии важных участков хромосом пациента с определением их точных геномных координат. Такая информация сопоставляется с референсными базами данных, аннотируется, что позволяет точно определить значение обнаруженного дисбаланса для конкретного пациента.

Хромосомные аномалии являются самой частой причиной множественных пороков развития и умственной отсталости. Однако, большинство хромосомных аномалий не может быть выявлено с помощью стандартных цитогенетических методов изза своего малого размера. Хромосомный микроматричный анализ определяет структурные перестройки хромосом, размер которых в 400 раз меньше, чем те, которые определяются обычным анализом кариотипа. Хромосомный микроматричный анализ является тестом первой линии для диагностики причин врожденных пороков развития и умственной отсталости у детей. Он позволяет диагностировать все известные делеционные и дупликационные синдромы и другие несбалансированные хромосомные аномалии, размером от 100 000 п. н. по всему геному. Другим преимуществом хромосомного микроматричного анализа является возможность определять участки отсутствия гетерозиготности, которые, в некоторых случаях, являются следствием одноро-

дительской дисомии, когда оба таких участка наследуются от одного из родителей. Метод не выявляет сбалансированных хромосомных перестроек.

Исследование позволяет определить следующую хромосомную патологию:изменение числа хромосом (анеуплоидии и полиплоидии);

большие хромосомные перестройки (делеции и дупликации);

субмикроскопические микроделеции и микродупликации;

участки отсутствия гетерозиготности.

Преимущество ХМА

Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) позволяет диагностировать хромосомные перестройки размером от нескольких тысяч пар оснований до 5 Мb, не видимые в стандартный цитогенетический микроскоп, которые обозначены как вариации числа копий участков ДНК (CNV).

Клиническое значение CNV определяется размером перестройки, количеством и составом генов, входящих в этот участок, а также ее происхождением. С учетом того, что в области CNV находится несколько генов, при их утрате или удвоении генетической информации развиваются более сложные клинические проявления. Без проведения хромосомного микроматричного анализа портретная (фенотипическая, по внешним проявлениям), диагностика большинства микроделеционных и микродупликационных синдромов не представляется возможным.

Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) также применяется для диагностики недифференцированных синдромальных форм моногенных заболеваний в случае делеции (утраты) генов, если пациент имеет сходный с заболеванием клинический фенотип.

Аналогично стандартному анализу кариотипа, с помощью ХМА можно выявить хромосомные анеуплоидии у пациента (некратное изменение хромосомного набора, связанное с наличием дополнительной или отсутствием целой хромосомы).

Хромосомный микроматричный анализ позволяет выявить участки с потерей гетерозиготности, что актуально при однородительских дисомиях.

Ограничения ХМА

Хромосомный микроматричный анализ не выявляет сбалансированные хромосомные транслокации, инверсии, низкоуровневый мозаицизм, точковые мутации, экспансию тринуклеотидных повторов, а также изменения, находящиеся за границей разрешающей способности метода.

Интерпретация клинической значимости структурных изменений, выявленных по хромосомному микроматричному анализу, проводится по специализированным базам данных (например, OMIM).

Особенности метода:

1.Метод не определяет сбалансированные хромосомные перестройки.

2.Достоверно не определяется низкий уровень мозаицизма (менее 20%), а также часть полиплоидий.

3.Минимальный размер определяемых микроделеций/микродупликаций зависит от типа используемых микроматриц.

4.Возможно получение результатов неясной клинической значимости. В связи с этим необходимо иметь максимально полную информацию об обследуемых и иногда бывает необходимо проведение дополнительного исследования родственников.

Возможный материал для исследования:

1.Венозная кровь (взятая в пробирки с ЭДТА), количество 1-2 мл. Кровь с ЭДТА может храниться в холодильной камере (+4°С - +8°С) не более суток. Замораживанию не подлежит.

2.Ткани (100 - 200 мг) в физрастворе. В случае невозможности доставить образец в лабораторию в течение 24 часов допустимо замораживание образца ткани на -20 и хранение в морозильной камере (-10°С - -20°С) - до 2-х недель.

3.Ворсины хориона, биопсия плаценты (не менее 50 мг). Обязательна доставка образца в лабораторию в день биопсии.

4.Амниотическая жидкость - не менее 4 мл. В случае культуры клеток - 1 мл.

6. Рассмотреть ключевые отличия молекулярного цитогенетического анализа от классических цитогенетических методов

Таблица 6

Ключевые отличия молекулярного цитогенетического анализа от классических цитогенетических методов

	Хромосомный
Характеристика	микроматричный	Кариотипирование	FISH
	анализ
Разрешение	Высокое (от 50 kb)	Низкое (5-10 mb)	Среднее (80-200
Разрешение	Высокое (от 50 kb)	Низкое (5-10 mb)	kb)
			kb)
	Любой материал,	Делящиеся клетки,	Делящиеся клетки,
Тип материала	Любой материал,	необходимость	необходимость
Тип материала	содержащий ДНК	необходимость	необходимость
	содержащий ДНК	культивирования	культивирования
		культивирования	культивирования
	Автоматизированная	Требуется специалист	Лёгкая интепретация,
	обработка результатов,	высокого уровня для	но результат виден
Интерпретация	исключающая	высокого уровня для	только в заранее
Интерпретация	исключающая	правильной оценки	только в заранее
	субъективизм	правильной оценки	определенных
	субъективизм	результатов	определенных
	исполнителя	результатов	локусах
	исполнителя		локусах

	Лабораторные показатели
Специфичность			++++
	++++	++	только для
			известных локусов

Чувствительность			++++
	++++	+	только для
			известных локусов
Разрешение	++++	+	++++
	Гетерозиготность
Однородительские	Да	Нет	Нет
дисомии
Родство	Да	Нет	Нет
Потери	Да	Нет	Нет
гетерозиготности

Примечание	Молекулярная	Диагностика грубой	Подтверждение
	диагностика множества	хромосомной	диагноза
	генетических дефектов	патологии

Варианты хромосомного микроматричного анализа:

1.Стандартный. Используется микроматрица средней плотности (750 тыс. маркеров).

2.Расширенный. Применяют микроматрицу высокой плотности (2,67 млн. маркеров).

3.Таргетный. Проводят с использованием микроматриц, имеющих 350 тыс. маркеров.

Стандартный и расширенный хромосомный микроматричный анализ позволяет установить причины хромосомной патологии при наличии недифференцированных синдромов у детей с задержкой психомоторного развития, аутизмом, множественными врожденными пороками развития, малыми аномалиями развития.

Таргетный ХМА используется при диагностике специфических синдромов, при необходимости их лабораторного подтверждения. Также он применяется для выявления

причин потери беременности (спонтанные аборты, замершая беременность, прерывание беременности по показаниям), для подтверждения полного пузырного заноса.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА:

1.Разобрать методы цитогенетической диагностики, их цели и методики проведения.

2.Определить область применения цитогенетических методов в практической медицине.

3.Интерпретировать кариотипы пациентов с распространенными хромосомными синдромами

47,ХХ,+21

47,ХХ,+18

45,Х	47,ХХY
4. Решить ситуационные	задачи, связанные с интерпретацией кариотипов пациентов.
Задача 1.	Задача 2.

Задача 3.

Задача 4.

Задача 5.

Задача 6.

5.FISH-диагностика.

5.1.Разобрать цель, показания и методику проведения FISH исследования.

5.2.По фотографиям определить типы хромосомных нарушений и связанные с ними заболевания.

Задача 1.

Задача 2.

Задача 3.		Задача 4.

ЗАНЯТИЕ № 3 Биохимические методы диагностики наследственных болезней обмена.

Программы и методы современного расширенного массового неонатального скрининга в России.

Цель занятия: Углубление и приобретение новых компетенций по современным биохимическим методам диагностики и профилактики наследственных болезней обмена. Изучение роли, организации и проведении расширенного неонатального скрининга в раннем выявлении детей с наследственными болезнями

Вопросы для самоподготовки:

1. Современные биохимические методы в диагностике и профилактике наследственных болезней обмена.

2.Принципы проведения неонатального скрининга.

3.Критерии наследственных болезней, выявляемых массовым неонатальным скринингом.

4.Новые технологии расширенного массового неонатального скрининга.

НЕОБХОДИМО ЗНАТЬ:

1.Современные биохимические генетические методы диагностики наследственных болезней обмена.

2.Современные возможности биохимических генетических методов в профилактике наследственных болезней обмена.

3.Принципы, этапы и содержание алгоритма расширенного массового неонатального скрининга.

НЕОБХОДИМО УМЕТЬ:

1.Интерпретировать информацию о генетическом риске развития наследственных болезней обмена.

2.Объяснять сущность генетического риска пациентам и членов их семей, а также оказывать помощь консультируемым семьям в принятии правильного решения по вопросу вероятности и последствий рождений в семьях больных наследственной патологией.

НЕОБХОДИМО ВЛАДЕТЬ:

1.Знаниями в области клинической генетики человека.

2.Знаниями в области биохимической диагностики наследственных болезней.

3.Навыками интерпретации результатов биохимического тестирования пациентов с

наследственной патологией.

ВНЕАУДИТОРНАЯ САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

1. Изучить основы метода тандемной масс-спектрометрии (ТМС).

Метод масс-спектрометрии – метод качественного и количественного анализа метоболитов, основанный на прямом измерении отношений массы к числу элементарных положительных или отрицательных зарядов ионов (m/z) в газовой фазе, полученных из испытуемого вещества. Заряд может быть обусловлен присоединением или потерей электрона, протона, катиона или аниона в зависимости от условий ионизации и состава образца. Данное отношение выражается в атомных единицах массы (а.е.м.) или в дальтонах (Да). Ионы, образовавшиеся в ионном источнике прибора, ускоряются и перед попаданием

вдетектор разделяются с помощью масс-анализатора. Эти процессы происходят в камере,

вкоторой насосная система поддерживает вакуум от 10-3 до 10-6 Па. Сигнал, отвечающий иону, представлен несколькими пиками, соответствующими статистическому распределению различных изотопов этого иона. Такой сигнал называется изотопным профилем (для небольших молекул), а отдельный пик, представляющий наиболее распространенный изо-

топ для атома, моноизотопным пиком. Результирующий масс-спектр является графиком

зависимости количества различных ионов от отношения m/z. При анализе сложных молекул возникает необходимость в двух и более последовательных масс-анализаторах для расшифровки молекулярной структуры. В приборе МС/МС (MSn) (тандемный массспектрометр) масс-анализаторы выстраивают последовательно друг за другом. Из ионов, разделенных в первом масс-анализаторе, отбирают неидентифицированные по своему строению частицы (родительские ионы) и разбивают их на более мелкие фрагменты столкновением с атомами инертного газа (диссоциация, активированная соударением, CID) или лазерным излучением. Этот процесс реализуется перед вторым массанализатором, при помощи которого анализируют продукты распада (дочерние ионы).

Масс-спектрометрический анализ дает важную качественную и количественную (с использованием внешнего или внутреннего стандартов) информацию (определение молекулярных масс, структуры фрагментов определяемых молекул) с пределом обнаружения от пикомоль [пмоль (10-12)] до фемтомоль [фмоль (10-15)].

2.Ознакомиться с программой расширенного скрининга новорожденных.

С1 января 2023 года Российской Федерации введена программа расширенного скрининга новорожденных на 36 нозологий.

Цели программы:

ранняя диагностика наследственных заболеваний;

оказание адекватной медицинской помощи детям с выявленными заболеваниями;

сопровождение и реабилитация детей с наследственными заболеваниями;

снижение инвалидизации пациентов;

повышение продолжительности и качества жизни детей с выявленными заболеваниями.

Неонатальный скрининг новорождённых проводится в медико-генетических консультациях (центрах) медицинских организаций субъектов Российской Федерации на следующие заболевания/ группы заболеваний:

1.Фенилкетонурия (классическая фенилкетонурия - Е70.0 МКБ-10) https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/482_1

2.Врождённый гипотиреоз (врождённый гипотиреоз с диффузным зобом — E03.0 МКБ-10; врождённый гипотиреоз без зоба — E03.1 МКБ-10; дисгормональный зоб — E07.1 МКБ-10; другие уточненные болезни щитовидной железы — E07.8 МКБ-10) https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/712_1

3.Муковисцидоз (кистозный фиброз с легочными проявлениями — E84.0 МКБ-10; кистозный фиброз с кишечными проявлениями — E84.1 МКБ-10; кистозный фиброз с другими проявлениями — E84.8 МКБ-10; кистозный фиброз неуточненный — E84.9

МКБ-10) https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/372_2

4.Галактоземия (нарушения обмена галактозы — Е74.2 МКБ-10); https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/375_2

5.Адреногенитальный синдром (врожденные адреногенитальные нарушения, связанные с дефицитом ферментов — E25.0 МКБ-10; другие адреногенитальные нарушения

— E25.8 МКБ-10; адреногенитальное нарушение неуточненное — E25.9 МКБ-10). https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/82_2

6.Дефицит биотинидазы (недостаточность других уточненных витаминов группы B — E53.8 МКБ-10)

7.Дефицит синтеза биоптерина (тетрагидробиоптерина) (другие виды гиперфенилала-

нинемии — E70.1 МКБ-10) https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/482_1

8.Дефицит реактивации биоптерина (тетрагидробиоптерина) (другие виды гиперфе-

нилаланинемии — E70.1 МКБ-10) https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/482_1

9. Тирозинемия, тип I (нарушения обмена тирозина — E70.2 МКБ10) https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/409_2

10.Болезнь с запахом кленового сиропа мочи (болезнь «кленового сиропа» — E71.0

МКБ-10) https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/385_2

11.Гомоцистинурия (нарушения обмена серосодержащих аминокислот - E72.1 МКБ-

10)https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/483_2

12.Пропионовая ацидемия (другие виды нарушений обмена аминокислот с разветвлен-

ной цепью — E71.1 МКБ-10) https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/681_1

13.Метилмалоновая ацидемия (метилмалонил КоА-мутазы недостаточность) (дру-

гие виды нарушений обмена аминокислот с разветвленной цепью — E71.1 МКБ-