3 курс / Фармакология / Диссертация_Болатчиев_А_Д_Антибиотикорезистентность_микроорганизмов

61

3.3.Заключение

Вструктуре аэробной микрофлоры, выделенной из язвенно-некротических очагов у госпитализированных пациентов с СДС, преобладает S. aureus, причем доля MRSA составляет 42,5%. Кроме того, обращает на себя внимание частое выделение Enterococcus spp., P. aeruginosa и Enterobacteriaceae spp., включая K. pneumoniae и K. aerogenes, а также низкая чувствительность микроорганизмов к карбапенемам и цефалоспоринам.

Многим госпитализированным больным с СДС показано применение системной антибиотикотерапии, которая должна назначаться с учетом локальных и региональных данных антибиотикорезистентности микроорганизмов. Лечение поверхностных открытых язв без выраженных признаков воспаления подкожной клетчатки может проводиться с помощью местных антимикробных препаратов и антисептиков [183].

В ходе проведенного исследования показан высокий уровень устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам. Очевидно, что требуется поиск новых безопасных и эффективных соединений, обладающих антимикробной активностью с целью разработки новых подходов к фармакотерапии СДС.

При сахарном диабете уровень иммунологической реактивности снижен (за счет ослабления функции лейкоцитов, факторов врожденного иммунитета,

ослабления фагоцитоза и бактерицидной активности фагоцитов), что увеличивает восприимчивость к инфекциям [115, 137].

В этой связи можно предположить, что низкая эффективность системной противомикробной терапии при СДС может быть связана не только с высоким уровнем антибиотикорезистентности, но и нарушениями иммунного статуса при сахарном диабете, а также нарушенной микроциркуляцией (что ухудшает проникновение системных антибиотиков в кожу и подкожно-жировую клетчатку).

Поэтому представляется интересным попытаться разработать препараты для наружного применения с целью усиления эффективности системной

62

антибиотикотерапии. С этой позиции большой интерес представляют антимикробные пептиды из класса дефензинов – HNP-1 и hBD-1 [147]. Кроме того,

учитывая, что данные пептиды продуцируются организмом для борьбы с инфекциями, важно исследовать их уровень в крови при СДС с целью оценки их роли в данном патологическом процессе.

63

Глава 4. УРОВЕНЬ ДЕФЕНЗИНОВ В КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С

СИНДРОМОМ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ СТОПЫ

У пациентов с СДС были определены уровни дефензинов HNP-1 и hBD-1 в

крови при поступлении в стационар (до начала лечения), а также перед выпиской – после проведенного лечения. Возраст пациентов (n=20) составил 66,8±9 лет, вес –

87±11,7 кг и рост – 172,8±8,3 см.

Результаты представлены в виде медианы с интерквартильным размахом

(25-й и 75-й процентиль).

У всех обследованных больных (n=20) концентрация HNP-1 крови как при поступлении, так и при выписке из стационара была выше нормальных значений.

Уровень α-дефензина-1 в крови у пациентов с СДС до начала лечения составил 15 (11,1; 18,8) нг/мл. Минимальное значение данного антимикробного пептида при поступлении составило 6,5 нг/мл (у пациента с трофической язвой левой стопы), а

максимальное значение составило 60,3 нг/мл – пациент с флегмоной правой стопы.

После лечения (перед выпиской) уровень HNP-1 снижался (p=0,0022) и составил

10,9 (6,5; 12,4) нг/мл, однако не достиг нормальных значений (у здоровых лиц –

3,54±2,97 нг/мл [52]). Минимальное значение α-дефензина-1 после проведенного лечения составило 1 нг/мл (флегмона II пальца левой стопы, проведено оперативное лечение: экзартикуляция II пальца левой стопы затем ампутация левой нижней конечности), а максимальное – 65,8 нг/мл (флегмона I пальца левой стопы,

проведено оперативное лечение: некрэктомия, ампутация I пальца левой стопы;

экзартикуляция I пальца левой стопы).

При определении концентраций β-дефензина-1 в крови у пациентов с СДС

(n=20) в целом прослеживались схожие тенденции. До начала лечения средний уровень hBD-1 составлял 42,4 (34,9; 62,8) нг/мл; минимальное значение концентрации данного пептида было 8 нг/мл у двух пациентов: пациента с

64

трофической язвой левой стопы (тот же пациент с минимальным значением α-

дефензина-1 при поступлении) и пациента с гангреной IV пальца правой стопы,

флегмоной правой стопы. А максимальный уровень – 92,8 нг/мл (флегмона I пальца левой стопы). После проведенного лечения концентрация β-дефензина-1 в крови достоверно снижалась – 33,4 (20,5; 42,1) нг/мл (p=0,0035), причем минимальный уровень составил 2,4 нг/мл (трофическая язва левой стопы), а максимальная концентрация – 70,4 нг/мл (флегмона I пальца левой стопы, проведено оперативное лечение: некрэктомия, ампутация I пальца левой стопы; экзартикуляция I пальца левой стопы). Проведенное лечение не приводило к снижению уровня hBD-1 до нормальных значений (у здоровых лиц верхняя граница нормы – 8,85 нг/мл [98]).

Результаты определения уровней HNP-1 и hBD-1, а также информация по проведенному объему хирургического лечения представлены в таблице 6.

Таким образом, уровень α-дефензинов-1 у пациентов с СДС имеет повышенные значения (по сравнению со значениями у здоровых лиц) как в момент необходимости начала стационарного лечения заболевания, так и после проведенного лечения в стационаре, хотя после лечения концентрация HNP-1

снижается. Вероятно, это связано с увеличением количества нейтрофилов при обострении процесса и инфицировании диабетической язвы. Тот факт, что даже после лечения (хирургического и/или фармакотерапии) уровень HNP-1 не достигает нормальных значений, может объясняться тем, что в целом сахарный диабет (и СДС, в частности) запускает в организме хронический иммуновоспалительный процесс. Постоянно повышенный уровень цитокинов при данном заболевании определяет «хронически» высокий уровень α-дефензина-1 [42].

Аналогичная тенденция наблюдалась и в отношении β-дефензина-1,

значения которого достоверно снижались на фоне проводимого лечения, однако так же, как и в ситуации с HNP-1, не достигали значений, определяемых у здоровых лиц.

65

Следует отметить, что при отдельном сравнении уровней дефензинов у пациентов с развившейся гангреной (n=8) было показано, что уровень HNP-1 также достоверно снижается на фоне лечения (p= 0,0013): у данных пациентов при поступлении уровень α-дефензина-1 был 15,5 (10,3; 18,5) нг/мл, а перед выпиской

– 10,2 (9; 12,4) нг/мл. Однако при сравнении концентраций β-дефензина-1 данная тенденция не прослеживалась – уровень hBD-1 не изменялся на фоне проводимого лечения: при поступлении – 38 (29,6; 46,9) нг/мл, после лечения – 38 (27,8; 41,7)

нг/мл (p= 0,5095) (в таблице 6 пациенты с гангреной выделены серым фоном).

4.1. Заключение

Полученные результаты позволяют высказать предположение о том, что

HNP-1 и hBD-1 играют важную роль в патогенезе сахарного диабета в целом и СДС, в частности. Тот факт, что данные антимикробные пептиды повышаются в момент необходимости госпитализации (связанной, как правило, с ухудшением состояния больных и, вероятно, обострением патологического процесса),

возможно, говорит об их защитной противомикробной функции и участии в процессах заживления ран.

Однако тот факт, что уровень β-дефензина-1 не снижается на фоне лечения у пациентов с гангреной, вызывает вопросы. Предположительно, вероятными причинами этого могут быть: облигатная анаэробная инфекция, выраженная сосудистая недостаточность (вызванная ранним развитием атеросклероза) и гибель мягких тканей.

Основываясь на полученных результатах, представлялось интересным исследовать возможность использования дефензинов HNP-1 и hBD-1 для разработки новых противомикробных препаратов для наружного применения с целью усиления эффективности системной антибиотикотерапии СДС.

67

Глава 5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

АНТИСТАФИЛОКОККОВОЙ АКТИВНОСТИ ДЕФЕНЗИНОВ IN VITRO И

IN VIVO

В экспериментальной части работы в качестве основного инфекционного агента использовались штаммы золотистого стафилококка (MSSA и MRSA),

выделенные у пациентов с СДС, т. к. данный микроорганизм занимает лидирующие позиции при бактериологическом исследовании отделяемого из гнойно-некротического очага и представляет наибольшую актуальность с позиции нарастающей антибиотикорезистентности (42,5% составляют метициллин-

резистентные штаммы). Кроме того, результаты измерения уровней антимикробных пептидов крови у больных с данной патологией позволили предположить, что α- и β-дефензины могут рассматриваться в качестве перспективных соединений для разработки новых подходов фармакотерапии инфекций, устойчивых к современным противомикробным препаратам, а также,

что немаловажно, рассмотреть дефензины как перспективные ранозаживляющие средства.

5.1. Моделирование взаимодействия антимикробного пептида HNP-1 и

компонента клеточной стенки бактерий – пептидогликана

На сегодняшний день механизм противомикробного действия дефензинов не до конца изучен – помимо пермеабилизации (прямого повреждения бактериальной клеточной стенки), вероятно, существуют и другие мишени действия антимикробных пептидов в микробных клетках. Одной из таких мишеней является пептидогликан.

С целью прогнозирования и анализа взаимодействия между молекулами пептидогликана (основного компонента клеточной стенки) и HNP-1 методами компьютерной химии были изучены основные квантово-химические

68

характеристики, и проведен молекулярный докинг, позволяющий определить ориентацию между молекулами и образование устойчивого комплексного соединения. Особенностью клеточной стенки S. aureus, как и всех грамположительных бактерий, является то, что она представлена 5-6 рядами пептидогликана, который составляет до 90% сухой массы клеточной стенки.

Молекулярные свойства пептидогликана и HNP-1 сведены в таблице 7.

Таблица 7 – Молекулярные свойства пептидогликана и HNP-1

Полученные данные подтверждают корректность процедуры геометрической оптимизации молекулярных моделей. Величины потенциальной энергии для пептидогликана и HNP-1 являются малыми (-7838,5 и -2873,2 ккал/моль), что свидетельствует об устойчивом состоянии обеих молекул. Среднеквадратичный градиент приближен к нулевому значению (0,088 и 0,10 ккал/(Å×моль), что подтверждает эффективность минимизации потенциальной энергии и сбалансированность энергетических характеристик системы. Дипольные моменты характеризуют неравномерность распределения заряда на поверхности молекул

(212,3 – для пептидогликана и 44,5 Дебая – для HNP-1).

Эффективность разрушения клеточной стенки S. aureus можно проанализировать, используя метод молекулярного докинга, который позволяет определить ориентацию между молекулами для образования устойчивого комплексного соединения. Комплексы пептидогликана (рецептора) и HNP-1

(лиганда) являются фактором передачи химического сигнала между двумя молекулами (ингибирующий или каталитический). Результаты молекулярного докинга между пептидогликаном и HNP-1 представлены на рисунке 6 (A-D), они

69

свидетельствует, что обе молекулы имеют гидрофобные зоны (рисунок 6 (A, B).

Образование комплекса (рисунок 6 (С) происходит через одну из таких зон

(рисунок 6 (D). На рисунке 6 (С) видно, что молекула α-дефензина-1 проникает внутрь фрагмента пептидогликана. Для оценки пространственного расположения комплексного соединения была проанализирована структурная модель,

образовавшаяся во время докинга (рисунок 6 (E-F).

Модель комплексного соединения свидетельствует, что HNP-1 глубоко проникает в структуру фрагмента молекулы пептидогликана. Это свидетельствует о том, что на этапе докирования происходит снижение потенциальной энергии межмолекулярного соединения. Однако для окончательной оценки действия HNP-

1 на клеточные стенки S. aureus необходимо изучить молекулярные характеристики соединения, образовавшегося после докирования, таблица 8.

Таблица 8 – Молекулярные свойства комплексного соединения

Изучение молекулярных свойств докируемых молекул показало, что сумма Епот. двух молекул будет равна -10711,7 ккал/моль (-7838,5 + (-2873,2). Для образования устойчивого комплекса Епот. соединения должна быть ниже суммы энергий двух исходных компонентов. В данном случае потенциальная энергия комплекса равна достаточно высокому значению 549,3 ккал/моль. Это означает,

что соединение является нестойким, и взаимодействие HNP-1 и пептидогликана может приводить к нарушению целостности клеточных стенок либо к серьезным изменениям функциональных свойств исследуемого микроорганизма, что,

вероятно, будет проявляться в виде продольно-поперечных линейных разрушений вдоль всего диаметра бактериальной клетки.

70

Рисунок 6. Этапы молекулярного докинга; A) молекула α-дефензина-1 (HNP-1); B)

фрагмент молекулы пептидогликана; C) промежуточный этап докирования; D)

комплексное соединение; E) структурная модель комплекса фрагмента пептидогликана с HNP-1 (фронтальная проекция); F) – она же, проекция сбоку.

Таким образом, компьютерное моделирование позволило получить данные о взаимодействии дефензинов и пептидогликана, которое может приводить к гибели микробных клеток путем разрушения клеточной стенки. Для подтверждения и визуализации полученных данных была использована высокоразрешающая атомно-силовая микроскопия.