двулучепреломлением, например отдельные микротрубочки [25]. В приложении к светлопольной или поляризационной микроскопии с эпиосвещением VEC-метод позволяет выявлять частицы коллоидного золота диаметром 5—20 нм, которые используются в иммуноцитохимических методиках при электронной микроскопии [29, 30]. Помимо наблюдений за перераспределением и поведением меченных золотом антигенов в живых клетках с помощью VEC-микроскопии можно проводить быстрый скрининг в световом микроскопе меченных золотом препаратов для электронной микроскопии, а также исследовать полутонкие, а иногда и ультратонкие неокрашенные электронно-микроскопические срезы залитого в пластик материала (рис. 8.2).

Улучшение изображений движущихся объектов может быть достигнуто за счет применения цифровых процессоров. Процедура «отслеживания» состоит в том, что кадры добавляются в видеопамять через заранее выбранный интервал времени, в результате чего генерируются изображения, отражающие множество последовательных положений движущихся объектов. Прыгающее усреднение с интервалом в несколько секунд позволяет визуализировать процессы, слишком медленные для того, чтобы их можно было наблюдать другими способами, например рост клеток, движение хромосом, движение клеток. Непрерывное усреднение может использоваться для того, чтобы отфильтровывать движения, скорости которых больше, чем предварительно заданные. С помощью вычитания изображений, находящихся в фокусе, можно оставить в конечном изображении только движущиеся объекты, удалив неподвижные детали (рис. 8.5). Вычитание через определенные интервалы времени (разд. 1.3.3, IV) может быть использовано для фильтрации (выявления) только медленно движущихся объектов. Будут ли видны частицы с данной скоростью движения, зависит от того, какова продолжительность интервала времени, через который в качестве фонового изображения берегся следующее. Для того, чтобы выявить также и более медленно движущиеся объекты, нужны будут очень большие интервалы времени, за которые производится усреднение.

3. Слабый свет: микроскопия с видеоусилением (VIM-метод)

3.1. Введение

Для данного метода требуются специальные чувствительные телекамеры или модули усилителей изображения, которые упоминались в разд. 1.4.2. После того как изображение прошло аналоговое усиление и было записано, к нему можно применить методы цифровой обработки, как в VEC-микроскопии (разд. 2.3). Первым и наиболее существенным результатом такой обработки является увеличение отношения сигнал/шум, происходящее в процессе улучшения изображения с помощью, например интегрирования, усреднения или цифровой фильтрации. Во-вторых, с помощью цифровой обработки удаляется шум* с фиксированным распределением, такой как крап, неравномерность освещения, фоновая флуоресценция или любые неоднородности, возникающие в камере или в процессе цифровой обработки (вычитания фона или крапа). В третьих, она может быть использована для цифровых манипуляций с контрастом. Четвертый и наименее существенный этап в VIM-методе — это оттенение или маскировка движения. Основная особенность этих операций в VIM-методе по сравнению с VEC-микроскопией состоит в том, что с помощью первого можно исследовать, как правило, только статические или малоподвижные препараты. Изображения таких препаратов требуют обработки, описанной в разд. 3.2.2, обработка же изображений подвижных препаратов (разд. 3.2.3) сходна с той, которая применяется при VEC-микроскопии.

3.2. Процесс формирования изображения

3.2.1. Условия, касающиеся микроскопа

Для осуществления VIM-метода не требуется специальных или необычных приспособлений к микроскопу. Конечно, для этого надо иметь хорошие навыки работы с микроскопом, связанные с очисткой оптических поверхностей, тщательной установкой системы освещения и телекамеры в ходе лучей. Есть, однако, много практических вопросов, которые важны для получения наилучших результатов при использовании VIMметода.

1.Если при наблюдении в видимой области спектра используется телекамера, обладающая повышенной чувствительностью в красной области (например, камера с многощелочным катодом), то нужно применить хотя бы один высококачественный инфракрасный отсекающий фильтр, который устанавливается на пути световых лучей в камере. Несмотря на то, что человеческий глаз и фотопленка нечувствительны к длинноволновой части спектра, все же при видеомикроскопии данный свет может значительно ухудшить качество изображения. Это относится и к тем случаям, когда в микроскоп вставлены хорошие фильтры для флуоресценции, так как последние печально известны своим пропусканием в области длин волн больше 700 нм.

2.Изображение для камеры должно быть настолько парфокально, насколько это возможно, с изображением

вокулярах. При работе с изображениями очень малой интенсивности бывает очень трудно четко сфокусировать на мониторе изображение живого объекта.

3.Нужно оборудовать рабочее место в темной комнате или другим способом полностью защитить объектив от постороннего света. Этот свет легко регистрируется телекамерой с большим усилением, и качество

173

изображения соответственно страдает. Часто бывает необходимо закрывать даже окуляры микроскопа, например черной материей.

4.Если для уменьшения фотообесцвечивания при флуоресценции необходимо низкоинтенсивное освещение или планируется проводить количественные измерения, то необходим источник света с регулируемой мощностью. Небольшие флуктуации напряжения в линии будут значительно усилены камерами с усилителями яркости, так что рекомендуется использовать стабилизированные источники питания.

5.Полезно оборудовать микроскоп таким образом, чтобы можно было получить и сфокусировать хорошее оптическое изображение образца (светлопольное или полученное DIC-методом) до того, как свет низкой интенсивности будет направлен в телекамеру. Для уменьшения фотообесцвечивания при флуоресценции следует перед тем, как установить режим флуоресцентного наблюдения, просмотреть препарат в невозбуждающем свете.

6.Поскольку может потребоваться сравнительно долго проводить усреднение или интегрирование, микроскоп должен быть установлен как можно более прочно, чтобы не было вибрации изображения. Кроме того, многие телекамеры, используемые для слабого света, имеют большой размер, поэтому их полезно дополнительно укрепить, а не просто вставить в гнездо для камеры на микроскопе.

7.Следует позаботиться о том, чтобы предметные и покровные стекла, а также иммерсионные жидкости и т. д., с которыми предстоит работать, не обладали аутофлуоресценцией, или чтобы она была совсем незначительной.

8.Микроскоп должен быть снабжен набором нейтральных светофильтров. Они могут использоваться как для уменьшения освещения препарата, так и для защиты телекамеры от избыточного света.

3.2.2. Получение статических изображений

1.Убедившись в том, что свет не направлен в телекамеру, сфокусируйте препарат, глядя в окуляры.

2.Уменьшив до предела чувствительность камеры, направьте в нее свет. Если он оказывается слишком ярким, немедленно перекройте его. Прежде чем повторить процедуру, необходимо ввести в ход лучей нейтральные светофильтры.

3.Направив свет в камеру и получив изображение на мониторе, сфокусируйте препарат, если это необходимо, и увеличивайте чувствительность камеры до тех пор, пока для части изображения не начнется насыщение. После этого слегка уменьшите чувствительность, чтобы предотвратить перенасыщение изображения. Эта процедура позволяет быть уверенным в том, что используется полная амплитуда видеосигнала (1 V между пиками), и получать наилучшее отношение сигнал/шум. Другой способ состоит в том, чтобы увеличивать количество света, а не чувствительность камеры. К сожалению, это невозможно в двух случаях: когда яркость света ограничена или когда необходимо поддерживать низкую освещенность, чтобы уменьшить фотообесцвечивание, фототоксический эффект, фототропный эффект и т. д.

4.Настройте монитор для оптимального качества картинки.

5.Если камера снабжена усилителем и системой напряжения смещения, то отрегулируйте их для получения наилучшего качества изображения по всему полю или наилучшего изображения интересующей вас части препарата (этап 5 в разд. 2.3).

6.Проинтегрируйте изображение достаточного числа кадров. В зависимости от качества «сырого» или аналоговым образом обработанного изображения вам понадобится от 2 до 512 кадров. Выбранное число зависит от ваших требований к качеству получаемого изображения в соответствии с каким-либо выбранным критерием, например отношением сигнал/шум. Поскольку это отношение пропорционально квадратному корню из числа кадров, то достаточное уменьшение его может быть получено при интегрировании 128—256 кадров. Следует отметить, что максимальное число интегрируемых кадров может быть ограничено максимальным числом уровней серого в цифровой памяти изображений. Системы для слабых изображений должны быть снабжены памятью глубиной по крайней мере 12, а лучше 16 бит, чтобы они позволяли проводить значительную интеграцию.

7.Установите и поддерживайте фоновое изображение. Фоновое изображение можно получить двумя способами. Лучше всего найти подходящую фоновую область непосредственно около объекта. Она будет содержать все компоненты изображения, которые в идеале следует удалить. Такими компонентами являются: крап от камеры, неравномерное освещение, оптические дефекты, аутофлуоресценция в системе и любой шум в системе цифрового усиления. Если такую область найти не удается, то надо применить другой способ — перекрыть свет, попадающий в камеру, и использовать в качестве фона «темновое» изображение. Последнее позволит откорректировать все дефекты, связанные с телекамерой (рис. 8.12).

174