3 курс / Фармакология / Фармацевтическая_технология_Том_2_НФаУ

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

Для выращивания микроорганизмов-продуцентов применяют два способа культивирования - поверхностный и глубинный.

Твердофазная ферментация. Культивирование на поверхности твердой среды обычно осуществляют в увлажненной твердой, сыпучей или пастообраз­ ной среде, влажность которой составляет 30-80%. Если субстрат сыпучий, то его отдельные твердые частицы хорошо контактируют с воздухом. Рост микро­ организмов в этом случае происходит главном образом на поверхности или в порах твердых частиц. Обеспечение микроорганизмов кислородом затрудняется с увлажнением слоя субстрата. Перемешивание слоя не допускается, если куль­ тивируются мицелляльные микроорганизмы. Другая проблема при твердофаз­ ной ферментации - отвод теплоты и поддержание постоянной температуры во всей ферментационной среде.

Метод твердофазной ферментации широко используют в Японии для производства грибных ферментов лимонной кислоты. В Германии, Франции, Великобритании от него отказались, так как он требует слишком больших пло­ щадей для эксплуатации, трудно предотвратить заражение микроорганизмами,

авыход продукта биосинтеза невелик.

Впроизводстве грибной амилазы главным компонентом питательной сре­ ды является смесь пшеничных отрубей и крахмала, иногда к ним добавляют белковые отходы, солодовые ростки, получаемые в производстве пива, соевую муку и т.п.

Для выращивания производственной культуры компоненты питательной среды смешивают, распределяют тонким слоем в кюветах, увлажняют мицелляльным раствором, содержащим небольшое количество хлористоводородной кислоты, стерилизуют при давлении 0,15 МПа в течение одного часа или ост­ рым паром в течение 30 минут, а затем охлаждают. В охлажденную до 35°С пи­ тательную среду вносят суспензию спор Aspergillus oryzae.

Стерильную засеянную спорами Aspergillus oryzae питательную среду в кюветах помещают в камеры для выращивания, в которые подают очищенный воздух, с определенной температурой и относительной влажностью. Через 30­ 36 часов инкубации для культуры гриба Aspergillus oryzae в этих камерах при температуре 30°С развивается масса спорообразующего мицелия. Массу сни­

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

Подготовленная, простерилизованная и засеянная культурой гриба Aspergillus orizae питательная среда загружается в растительные камеры и по рельсовому пути подается в растительное отделение, через диффузоры к каме­ рам подается кондицинированный воздух. Аэрирование культуры осуществля­ ется через вертикальные каналы, имеющиеся между кюветами и через отвер­ стия в стенках кювет. Система аэрация рассчитана на рециркуляцию и очистку воздушного потока, подсос свежего воздуха и поддержание условий, предот­ вращающих подсыхание выращиваемой культуры. Процесс культивирования проводят в течение 42-46 часов. После этого производят разгрузку раститель­ ных камер на вибрационном столе, отделив предварительно вертикальную стенку кюветы. Освобожденная от культуры камера перемещается по рельсово­ му пути в моечное отделение, затем в стерилизатор и на вибрационный стол для новой загрузки.

Выращенную поверхностную культуру гриба передают на стадию экс­ тракции, минуя операцию сушки, измельчения и фасовки, имеющих место при серийном производстве «амилорозина - П».

Использование механизированной линии по выращиванию культуры гри­ ба Aspergillus orizae дает возможность поддерживать высокий уровень стериль­ ности, что очень важно для целенаправленного синтеза амилазы. В случае не­ обходимости можно оперативно локализовать и изолировать инфицированный материал безопасности заражения сопутствующей микрофлорой других камер.

Глубинный аэробный процесс. Этот современный метод обладает мно­ гими преимуществами по сравнению с более ранними методами поверхностно­ го культивирования. Применение глубинного метода позволяет повысить эф­ фективность использования производственных площадей, увеличить масштабы производства, механизировать трудоемкие работы и почти полностью автома­ тизировать технологический процесс получения биопродукта. Кроме того, вы­ ход продукта выше, а опасность заражения невелика. Хотя технологии поверх­ ностного способа культивирования более экономичны, поскольку при его при­ менении себестоимость продукта и расход электроэнергии значительно ниже.

Глубинное культивирование может быть периодическим или непрерыв­ ным процессом.

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

ный фосфатными или карбоксильными группами клеточной стенки. Флокули­ рующие агенты (аммония сульфат, кальция хлорид) нейтрализуют заряд и спо­ собствуют образованию больших агрегатов клеток, которые легко оседают из культуральной жидкости. После предварительной обработки культуральную жидкость центрифугируют или декантируют.

Альтернативой центрифугирования служит фильтрование. Для фильтра­ ции небольших объемов культуральной жидкости обычно используют нутчфильтры, друк-фильтры, вакуум-барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры. Пресс-фильтры применяют для обработки значительных объемов жидкости.

С целью улучшения процесса фильтрации используют дополнительный слой из материалов, имеющих высокие гидродинамические свойства - перлит, уголь активированный и др. Осветление фильтратов проводят микрофильтрова­ нием через мембраны с диаметром пор от 0,45 до 0,8 мкм.

Выделение и химическая очистка включает ряд процессов: от обработ­ ки нативного раствора до сушки готового продукта.

Обычно после центрифугирования биомассу получают в виде густой жидкости или пасты с влажностью 70-85%. Клеточную массу промывают, фильтруют, сушат, гидролизуют, экстрагируют из нее нужный фермент. Если ферменты находятся в растворе, биомассу используют после отделения как по­ бочный продукт, а нужное вещество выделяют из раствора различными мето­ дами: осаждением, фильтрацией, экстракцией и др.

Для получения высокоочищенного фермента применяют высаливание, диализ, электродиализ, мембранную фильтрацию, гель-фильтрацию, ионооб­ менную хроматографию, аффинную хроматографию, различные методы сорб­ ции. Концентрирование растворов, содержащих ферменты, осуществляется ва­ куум-выпариванием или вымораживанием.

Одним из прогрессивных методов очистки является ультрафильтрация, позволяющая проводить разделение в соответствии с размером молекул и моле­ кулярной массой вещества. Основной характеристикой ультрафильтрационной мембраны является средний предел полного деления частиц глобулярного бел­ ка, которые не проходят через мембрану. Наличие широкого ассортимента мембран с пределами отсечения от 1 тыс. до 1 млн. Дальтон позволяет отде­

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

лять примеси, очищать, концентрировать и обессоливать целевой продукт. Ультрафильтрация осуществляется в тангенциальном потоке, обессоливание или удаление низкомолекулярных примесей - в режиме диафильтрации, т.е. при постоянном объеме фильтруемой жидкости, за счет восполнения фильтрата равным объемом воды или буферного раствора.

После выделения и химической очистки фермента его необходимо высу­ шить - удалить из полученного препарата свободную и связанную воду. По­ скольку ферменты в основном термолабильны, для их высушивания необходи­ мо применять методы, не приводящие к потере биологической активности. На современном этапе промышленного получения ферментов, используют различ­ ные методы обезвоживания препаратов. Широкое распространение получила лиофильная сушка ферментов, которая проводится при сравнительно низких температурах (-10) - (-15) °С. При работе с большими количествами раствора, содержащим ферменты, проводят высушивание с применением распылитель­ ных сушилок.

Одной из важных операций химической очистки ферментов является кри­ сталлизация. В зависимости от химического строения фермента и его физико­ химических свойств применяют следующие методы кристаллизации: выпарива­ ние растворителя (изотермический), охлаждение горячего раствора (изогидрический), одновременное охлаждение и выпаривание (комбинированный), до­ бавление в раствор других веществ, снижающие растворимость (высаливание), вымораживание.

После высушивания препарат, в случае нестойкости, необходимо смеши­ вать со стабилизатором или с наполнителем (крахмал, декстрины, неорганиче­ ские нейтральные соединения, тальк и др.).

Лекарственные ферментные препараты из микробиологического сырья, выпускаемые предприятиями медицинской и микробиологический промыш­ ленности стран СНГ и ближнего зарубежья представлены в таблице 13.4

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

Продолжение таблицы 13.4